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ENTRADAS SOBRE NOTAS CIENTÍFICAS

Quimeras: bio-marcadores de multi-epítopos

Quimeras

Figura 1.Quimeras

En Rekom Biotech nos hemos especializado en el diseño y la producción de bio-marcadores de última generación: quimeras o bio-marcadores compuestos por múltiples epítopos, que han mejorado sus propiedades antigénicas, como son la sensibilidad y la especificidad.

ANÁLISIS DE EPÍTOPOS

Análisis de epítopos

ANÁLISIS DE SECUENCIA

Análisis de secuencia

ESTUDIOS 3D

Estudios 3D

Quimeras de Rekom Biotech

ENFERMEDAD/ALERGIA NOMBRE REFERENCIA DESCRIPCIÓN

Escrito por Ana Camacho.

CATEGORÍA: NOTAS CIENTÍFICAS

Bio-marcadores biotiniliados

Bio-marcador biotinilado

Figura 1. Bio-marcador biotinilado

Por muchas razones, un bio-marcador conjugado puede ser la solución a problemas diversos en el desarrollo de un test de diagnóstico. Un problema frecuente de la mayoría de las superficies es la desnaturalización de la proteína unida a ellas debido a la alta hidrofobicidad de estas. Además, debido a la proximidad de la superficie con estas moléculas suelen darse problemas de impedimentos estéricos en procesos de unión a otras moléculas como anticuerpos. Una orientación adecuada a la superficie puede incrementar la estabilidad de la proteína unida y puede también aumentar su sensibilidad si la molécula gracias a esta orientación expone sus regiones de unión.

Los métodos convencionales de conjugación generalmente funcionan bien con anticuerpos, sin embargo, los resultados obtenidos con antígenos son menos constantes, sobre todo en aquellos cuya estructura 3D no ha sido bien establecida. Esta es probablemente la principal razón por la cual los ELISAs de sándwich de doble antígeno (DAS-ELISA) no son tan frecuentes en el mercado como los ELISAs indirectos.

Para evitar este efecto en la estructura del antígeno causada por los sistemas convencionales de conjugación que pueden disminuir la sensibilidad del DAS-ELISA, en Rekom Biotech hemos desarrollado una línea de bio-marcadores biotinilados, ofreciendo a nuestros clientes los mismos antígenos de nuestro catálogo, pero con una biotina en su extremo C-terminal. Esta molécula permite la unión específica de los antígenos biotinilados a la estreptavidina.

¿Por qué biotinilados?

La unión extremadamente específica y de alta afinidad entre la biotina y la avidina y/o estreptavidina (Kd ≈ 10-14M) da lugar a sistemas de detección de alta sensibilidad. Una ventaja clara es que, con sólo una estreptavidina conjugada con peroxidasa, podemos usar todas nuestras referencias en formatos de captura o inmunométricos sin necesidad de tener que conjugar todas ellas.

La biotina va unida a un linker que la separa de la superficie del bio-marcador, evitando posibles impedimentos estéricos con las regiones antigénicas presentes en la superficie del antígeno. De esta manera, la interacción con el anticuerpo no se verá comprometida con la conjugación.

Interacción entre un antígeno y la región Fab de un anticuerpo

Figura 2. Interacción entre un antígeno (verde) y la región Fab de un anticuerpo (rosa). En rojo se muestran los amino ácidos que generalmente son usados para llevar a cabo la conjugación de la molécula. Algunos de estos amino ácidos son parte de los epítopos del antígeno. Esta conjugación interferiría con la unión del anticuerpo, disminuyendo la capacidad antigénica del bio-marcador.

Al unir siempre una biotina por molécula de proteína, nuestros bio-marcadores conjugados presentarán una mayor reproducibilidad y esto favorecerá a la reproducibilidad de los test de diagnóstico de nuestros clientes.

Usos biotinilados

  1. Orientación del antígeno en placas recubiertas con estreptavidina.

    Orientación en placas

  2. Detección en ensayos de captura de IgMs.

    Ensayos de captura

  3. Detección en ensayos DAS.

    Ensayos DAS

  4. Unión a oro y otras nanopartículas recubiertas con estreptavidina.

    Unión a oro

Bio-marcadores de Rekom Biotech biotinilados

ENFERMEDAD/ALERGIA NOMBRE REFERENCIA DESCRIPCIÓN

Escrito por Ana Camacho.

CATEGORÍA: NOTAS CIENTÍFICAS

Diseño al servicio de la ciencia

Human cytomegalovirus (HCMV) is endemic to populations throughout the world, and 50-80% of the adults in developed nations are sero-positive for this virus. Commercial ELISAs for detecting IgG are very sensitive and specific. Nevertheless, there are several problems regarding IgM detection. One of the difficulties that the diagnostic laboratory has faced over the past 10 years is the lack of agreement between commercial tests for the detection of CMV-specific IgM. This lack of agreement has its roots in the different viral preparations used to detect IgM antibodies to CMV. Rekom Biotech has performed the design of a new CMV recombinant polyepitope chimeric antigen (RAG0109), composed by different sensitive and specific antigenic determinants from some CMV proteins. This recombinant polyepitope chimeric antigen was tested in parallel with other CMV bio-markers such as the Rekom Biotech CMV recombinant proteins pp150 (RAG0091) and pp52 (RAG0090) and pp65 (RAG0016). The in house indirect IgM ELISA assay was carried out by using a battery of pre-validated sera with the commercial ELISA capture IgM test from Vidas:

Indirect IgM ELISA assay
Figure 1: Indirect IgM ELISA assay. Proteins were coating the plates at a final concentration of 1 µg/ml. All these experiments used anti-IgG as sorbent and anti-IgM-HRP. Sera were used in a 1:100 dilution. P means pre-validated sera by the Vidas test as positive; N means pre-validated sera by the Vidas test as negative.

These preliminary experiments suggest that the recombinant polyepitope chimeric antigen designed and produced by Rekom Biotech, RAG0109, recovers some pre-validated IgM positive sera which are not initially detected by two of the best antigens described in bibliography for CMV diagnosis: pp52 and pp150, showing the presence in merely one antigen of some important epitopes for this specific diagnostic.

To find more interesting information on regards recombinant antigen RAG0109, please click here.

Written by Ana Camacho.

CATEGORÍA: NOTAS CIENTÍFICAS

Rekom Biotech publica un estudio técnico sobre la titulación de antígenos

Recently, ReKom Biotech has published a white paper concerning good practices for antigen titration. This may be seen as an old issue. However, from the point of view of a data analyst the approaches in the literature are not really convincing. Titration experiments should be designed to obtain the most information on how to use the antigen at the lowest cost, that is, with the lowest number of experiments. It should be noted that, while the antigen may be used for quantitative or qualitative analysis, the titration experiments should be designed differently in both cases. The published paper is focused on qualitative analysis since the main goal of the titration experiments in ReKom Biotech is to convince our customers of the high quality of our products. We have devoted considerable efforts to develop titration procedures to indicate the customers at which concentration the antigen best discriminates between positive and negative serum of a given disease. Existent and widely used procedures present several drawbacks. For instance, in most standard titration experiments, such as in Chequerboard Titration (CBT), one single positive and negative sera are employed. From a statistical point of view, this is not a good approach since results are very dependent on the specific sera chosen. On the other hand, when several positive and negative sera are included in the experiment, the results are not assessed with the adequate tools. For instance, we could not find a single paper which compared the outcomes of positive and negative sera with a simple test of significance. The white paper we have published is intended to show clients that we use well-grounded methods to measure the quality of our products, and also to give details on these methods.

"Tritation Experiments"

Written by Jose Camacho Páez.

CATEGORÍA: NOTAS CIENTÍFICAS

Pequeños consejos - grandes pasos

The possibility to use ammonium hydroxide to control the pH in fed-batch microbial fermentations would have the advantage over sodium hydroxide that it could be used as a nutrient thus avoiding the increase of the media osmolality. However, this reaction equilibrium should be analysed carefully:

NH3 + H2O = NH4+ + OH-

At 25ºC and infinite dilution:

[NH4+][ OH- ]/[ NH3]  =  0.000018

And when temperature or pH rises, free ammonia could be given off, polluting the outlet gas of the bioreactor with this extremely toxic component.

NH4+ + OH- = NH3 ­ + H2O

Due to this reason, ammonium hydroxide only could be used as pH corrector in solutions which are slightly acid, thus in the case of pH = 5, where pOH = 14-5 = 9.

[ NH4+](0.000000001)/[ NH3]  =  0.000018 [NH4+]/[ NH3] =18000

In this particular case, the main quantity of the ammonium hydroxide appears to be in the form of ammonium ion which will be consume as nitrogen source and therefore it could be used to rise the pH without the production of free ammonia.

For this reason, ammonium hydroxide shouldn´t be used to adjust the pH in fed-batch microbial fermentations of Escherichia coli where pH 7 is necessary, but it would be very convenient in the case of the methylotrophic yeast Pichia pastoris which optimal growth takes places at pH 5.

Written by Fernando Camacho Rubio.

CATEGORÍA: NOTAS CIENTÍFICAS