La importancia de un control de amplificación interno para diagnóstico de ensayos qPCR

Sigue siendo sorprendente que hoy en día, uno de los principales inconvenientes de la mayoría de las PCR publicadas es que no contienen un Control Interno de Amplificación (IAC) adecuado. Un IAC es una secuencia de ADN no objetivo presente en el mismo tubo de muestra, que se coamplifica simultáneamente con la secuencia objetivo. Para comprender el uso de IAC óptimo, la revisión realizada por Hoorfar y colaboradores debe ser lectura obligatoria para todos los creadores de qPCR (Hoorfar et al., 2004). En una PCR con IAC, siempre se producirá una señal de control cuando no haya una secuencia diana presente. Cuando no se produce ni la señal IAC ni la señal objetivo, la PCR ha fallado. Su estudio presentó varias recomendaciones para el IAC óptimo a utilizar en PCR de diagnóstico que son realmente interesantes: El ADN objetivo y el IAC deben compartir los mismos sitios de unión de cebadores. Los amplicones IAC deben distinguirse fácilmente de los amplicones de ADN objetivo. No es estrictamente necesario que las eficiencias de amplificación del ADN objetivo y del IAC sean idénticas. La fuente de IAC debe ser ADN plasmídico que transporte la secuencia de IAC clonada o productos de PCR purificados. Dependiendo del método de detección del ensayo, el IAC debe detectarse mediante sondas de hibridación dependiente de la secuencia o por tamaño después de la electroforesis en gel. Solo se deben utilizar plantillas altamente purificadas. La concentración de IAC debe determinarse mediante titulación y su cantidad en el ensayo debe ser lo más baja posible, sin dejar de generar una señal a través de la amplificación. Se debe agregar IAC a la mezcla de PCR para garantizar una distribución equitativa en todos los tubos de PCR. A veces, sin embargo, es necesario amplificar una secuencia de un gen "constitutivo" (es decir, el gen ribosómico 16S) para comprobar la integridad del ADN purificado, pero no se debe sustituir la inclusión de un IAC. Además, se debe exigir la inclusión de un IAC en cualquier PCR desarrollado para uso diagnóstico, ya sea como herramienta de detección o de subtipificación. BIBLIOGRAFÍA Escrito por Ana Camacho.